Количественный анализ ПЦР на гепатит B: расшифровка, норма

Описание диагностического метода

Высокочувствительный метод ПЦР-диагностики гепатита В относится к категории генно-инженерных молекулярно-биологических исследований. Посредством него определяется количество вирусной ДНК в биологическом материале пациента и допустимая норма. По полученным результатам устанавливается число вирусных частиц в единице объема.

Значимость результата числа вирусных частиц, полученного метода ПЦР, превышает значение иммуноферментных исследований. Поскольку анализ в режиме real-time показывает присутствие возбудителя заболевания в крови, его информативность выше прочих. Если ИФА свидетельствуют только о наличии антител, что наблюдается с 4-х недель инкубационного периода и сохраняется более 8 недель после элиминации вируса из крови, то полимеразная цепная реакция однозначно подтверждает активное течение заболевания или его излечение, характеризует динамику назначенной терапии.

Полимеразная цепная реакция с количественным определением частиц возбудителя решает диагностические вопросы в пользу прекращения лечения в связи с выздоровлением или продолжения терапии из-за ее недостаточной эффективности. Метод максимально специфичен в отношении вируса HBV и отличается приемлемой погрешностью.

Полимеразная цепная реакция до недавнего времени была лишь экспериментальным методом анализа и не была широко распространена в клинической практике. Принцип методики основан на так называемой амплификации – способности определенного участка генома патогена  к многократному копированию.

Это достигается при помощи обязательных компонентов выполнения ПЦР: 

  • праймера, структура которого практически идентична определенным участкам РНК HCV,
  • фермента, обеспечивающего реакцию амплификации.

Сам процесс лабораторного исследования происходит в буферном растворе, в котором содержится фиксированная комбинация катионов и анионов. Таким образом возможно поддержание оптимального для течения ПЦР уровня рН. Набор для проведения ПЦР содержит и протеины, используемые в качестве своего рода «строительного материала» при амплификации.

Количественный анализ ПЦР на гепатит B: расшифровка, норма

Структура праймера такова, что он может взаимодействовать только со строго определенным возбудителем. На этом принципе основана специфичность анализа методом ПЦР. Если иммуноферментные серологические исследования зависят от индивидуальных параметров иммунной системы человека, ПЦР направлена исключительно на выявление РНК возбудителя HCV.

Еще одна особенность проведения подобного исследования состоит в том, что расшифровка ПЦР гепатита С возможна как с использованием компьютерных программ (обычно используется, когда необходимо количественно установить содержание вируса в крови) и микроскопических методов. В норме у здорового в плане вирусного поражения печени человека патоген в крови отсутствует. Выявление возбудителя HCV методом ПЦР, будь то качественное либо количественное исследование, однозначно указывает на инфицирование.

Виды тестов

При помощи постановки ПЦР можно не только определить виремию, то есть фактический уровень патогена в кровотоке, но и генотип вируса. Все доступные исследования, выполняемые по такой методике, приведены в таблице.

Перечень тестов Краткое описание
Анализ ПЦР на гепатит С качественный Предназначен для подтверждения результатов серологического теста (ИФА). Используемые тест-системы позволяют только выявить РНК патогена без определения его содержания
Анализ ПЦР вирусное содержание возбудителя патологии Чувствительность исследования составляет 5–10 МЕ/мл. Для удобства расшифровки используют универсальный параметр, так как при определении количества копий могут возникать различные погрешности. Исследование проводится в обязательном порядке и не может заменить ни качественный тест методом ПЦР, ни генотипирование
Генотипирование При исследовании определяется последовательность протеинов, что определяет разновидность возбудителя гепатита С. В настоящее время установлено 6 генотипов, и практически каждый требует индивидуального подхода в терапии

При гепатите С проводится все три исследования ПЦР. Алгоритм диагностики состоит в следующем:

  1. Общие клинические исследования («стандартный набор» – кровь, моча, биохимия и печеночные пробы), дополнительно могут назначать ревматоидные тесты и ряд других анализов при подозрении на аутоиммунные процессы;
  2. Серологическое исследование (ИФА) на выявление антител к возбудителю гепатита С. Изначально показан тест Anti-HCV Total.
  3. Качественная ПЦР, предназначена для подтверждения результатов ИФА.
  4. Количественная ПЦР, выполняется при подтвержденном диагнозе HCV-инфекции.
  5. Генотипирование, также проводится при установленном факте заражения. 

Если человек желает самостоятельно обследоваться на гепатит С, рекомендуют сдавать ИФА. Дальнейшие обследования проводят в зависимости от полученных результатов. Если ИФА отрицательный и человек не предъявляет никаких жалоб, повторное тестирование проходят через год. Но при наличии симптомов патологии (в том числе и неспецифических, например, сильная слабость, утомляемость, боли в правом подреберье) следует сдать качественную ПЦР.

Основы диагностики заболевания

Диагностика гепатита B основывается на оценке клинических проявлений, иммуноферментных и инструментальных методов исследований. Заболевание протекает в острой фазе после инкубационного периода и, в зависимости от дозы инфекции и эффективности лечения, переходит в хроническую стадию. Главной целью лечения остается предотвращение хронизации, то есть элиминация всех вирусных частиц из крови. Клиническая норма течения болезни — излечение без последующей виремии.

Поскольку любой качественный иммуноферментный анализ позволяет диагностировать HBV косвенно, то есть не показывают наличие возбудителя во внутренней среде организма, а характеризует иммунный ответ на инфекцию, то контроль эффективности терапии и факт излечения становится труднодоказуемыми. Потому пациенту с гепатитом B или с наличием диагностических критериев в его пользу должна проводиться полимеразная цепная реакция с целью количественного определения числа вирусных частиц в крови. Диагностическая норма — это отсутствие копий ДНК инфекта.

Характеристика количественного анализа

В целом, техника выполнения ПЦР по большому счету одинакова, как для качественного, так и количественного исследования. Образец биологического материала смешивают с тест-раствором, который содержит специальные соединения. Их роль состоит в стимуляции деления РНК патогена (причем строго специфичного генетического материала возбудителя).

В результате концентрация HCV достигает лабораторно определяемого уровня. На данном этапе возможно проведение качественного анализа. Однако после сложных подсчетов (обычно для этих целей используют компьютерные программы) устанавливают количественный показатель содержания HCV. После этого полученный результат переводят в Международные Единицы и фиксируют в лабораторном бланке.

В некоторых случаях вместо ПЦР используют другие методики – разветвленной ДНК и транскрипционной амплификации. Но из-за сложности выполнения и более низкой чувствительности большинство специалистов предпочитают выявлять количественные нормы гепатита С именно при помощи ПЦР. 

Показания

Сейчас практически в любой частной лаборатории пациент может пройти обследования без каких-либо бумаг и направлений от терапевта. Количественное определение вируса гепатита С в крови не является исключением. Вопрос в том, когда целесообразна сдача теста?

Гепатологи рекомендуют проведение исследования в таких случаях:

  • позитивный ИФА положительная ПЦР;
  • негативный ИФА положительная ПЦР. 

Кроме того, количественное определение HCV показано и в ходе противовирусной терапии. Врач сравнивает результаты виремии, полученные до начала курса приема медикаментов, с результатами тестирования, проведенного уже во время лечения. Нормой считается негативная ПЦР к 12 неделе применения препаратов.

Тестирование продолжают и после окончания лечения для исключения риска рецидива. Пациент должен сдавать такой тест на протяжении еще 2 лет. При отрицательном результате говорят о выздоровлении. Больного снимают с учета у гепатолога или инфекциониста и дают общие рекомендации относительно восстановления состояния печени.

Если спустя 2 года количественный тест на HCV вновь положителен, все исследования повторяют заново. В таком случае предполагают повторное инфицирование и, возможно, другой генотип вируса. Но требуется новая схема лечения, а вероятность благополучного исхода существенно ниже. 

Сроки выполнения количественного определения вирусной нагрузки при подтвержденной HCV-инфекции указаны в таблице.

Особенности течения заболевания и лечения Этапы сдачи количественной анализа
Этап первичной диагностики Виремия перед началом приема противовирусных средств – важный параметр определения лечения и контроля эффективности терапии
4 неделя Анализ делают вне зависимости от схемы лечения и применяемых препаратов
12 неделя Исследование выполняется также в любом случае
24 неделя Тестирование делают в том случае, если курс терапии продолжается 24 недели
48 неделя Выполняют при 48-недельном курсе лечения (как правило, при применении интерферонов) и как контрольный тест после 12-недельной терапии
После завершения курса терапии С интервалом в 24 недели на протяжении 2 лет

Как подготовиться

Сама методика постановки ПЦР менее чувствительна к особенностям функционирования внутренних органов, иммунной системы. Однако это не исключает соблюдения правил подготовки к проведению теста. В большинстве случаев количественный тест проводится при уже подтвержденном диагнозе гепатита С. 

Анализ крови на гепатит

Это подразумевает как минимум отказ от алкоголя и соблюдение строгой диеты (по столу №5 или №5а в зависимости от тяжести состояния больного). Лечащий врач уже ознакомлен с анамнезом, знает, какие лекарственные средства принимает пациент и от каких патологий страдает. Это облегчает расшифровку анализа ПЦР и снижает вероятность постановки ошибочного диагноза.

Но чтобы получить максимально точный результат необходимо:

  • сдавать кровь натощак (после ужина должно пройти не менее 12 часов, завтрак противопоказан);
  • посещать лабораторию следует в первой половине дня;
  • до сдачи крови нельзя есть и пить что-либо кроме воды;
  • нельзя курить за 8–10 часов до исследования.

Перечисленные правила нужно соблюдать перед каждой проверкой на количественное содержащие патогена. Если исследование проводят после лечения и врач разрешил ослабления в диете, за 7–10 дней до проведения тестирования необходимо вновь вернуться к строгому режиму питания. Что касается спиртного, ограничения сохраняются на протяжении всей жизни.

Показания и цели выполнения

Количественный анализ гепатита B является наиболее достоверным и позволяет подтвердить данные, полученные иммуноферментными методами. Он назначается при:

  1. получении положительного диагностического результата ИФА;
  2. лечении пациента с установленным диагнозом вирусного поражения печени;
  3. при диагностике гепатитов смешанной этиологии;
  4. при необходимости определения вирусной нагрузки у пациента.

Поскольку более широко в практике инфекциониста применяется метод иммуноферментного анализа, то часть пациентов с легким течением болезни можно лечить и не прибегая к необходимости подсчета вирусной нагрузки. Но ПЦР общепринято считается «золотым стандартом» диагностики в гепатологии, так как из-за однозначности своего результата снимает ряд организационных вопросов. Поэтому направление пациента на количественный анализ преследует следующие цели:

  • получение данных о числе вирусных частиц в крови пациента;
  • подтверждение острого течения гепатита и своевременной верификации хронизации заболевания;
  • постоянное выявление латентных вирусоносителей с положительными ИФА-тестами, мониторинг их виремии;
  • принятие решения о назначении антивирусного лечения, его комбинирования и прекращения.

Наиболее значимой целью применения количественного ПЦР-теста на выявление HBV является определение возможных комбинаций лечения. В случаях с высокой вирусной нагрузкой результат анализа дает специалисту возможность приступить к комбинированию препаратов. В ходе терапии на основании результата ПЦР легко определить эффективность назначенного фармакологического лечения.

Расшифровка количественного анализа крови на гепатит С

Ранее отечественные специалисты делили виремию на несколько групп: очень низкую, низкую, умеренную, высокую и очень высокую. Но в настоящее время расшифровка анализа крови на гепатит С проводится в соответствии с международными нормами. Сейчас виремию делят только на 2 группы. В таблице указаны вероятные данные количественного анализа на гепатит С (окончательная расшифровка вне зависимости от показателей должна проводиться врачом).

Результаты анализов Уровень вирусной нагрузки
7,9×105 МЕ/мл и ниже Низкая виремия
7,9×105 МЕ/мл и выше Высокая вирусная нагрузка
HCV не обнаружен Уровень РНК патогена ниже определяемого тест-системой порога (как правило, 5–10 МЕ/мл) либо полностью отсутствует. Виремия отрицательна

Но только специалист может грамотно расшифровать количественное исследование на HCV и отличить показатели нормы от критических, свидетельствующих об отсутствии результата от противовирусной терапии либо о рецидиве инфекции. Все анализы должны быть подшиты в амбулаторную карту, чтобы у доктора была полная информация об активности вирусной инфекции и ответной реакции на прием таргетных медикаментов.

Показатели нормы

Показатели нормы при расшифровке количественного анализа на гепатит С бывают только тогда, когда результат ПЦР отрицателен, то есть РНК вируса во взятом образце крови отсутствует. В остальных случаях наличие патогена свидетельствует о заражении. 

При подтверждении диагноза количественные показатели крови при гепатите С служат основой для оценки степени активности вирусного процесса. Высокая виремия повышает вероятность осложнений и сокращает срок наступления необратимых изменений в печени.

Вирусологическая нагрузка, превышающая 800 000 МЕ/мл служит основанием для проведения ряда инструментальных обследований:

  • эластографии – диагностического метода для определения степени фиброза (разрастания и размеров очагов соединительной ткани);
  • томографии – подробное рентгенологическое исследование, позволяющее исключить либо подтвердить наличие злокачественных или доброкачественных новообразований;
  • биопсии печени, которая дает максимально полную информацию о структурных изменения в органе.

Низкая вирусная нагрузка говорит о медленно развивающейся вирусной инфекции. Такой процесс не исключает прогрессирования поражения печени, но вероятность возникновения тяжелого декомпенсированного цирроза или гепатоцеллюлярной карциномы низка. У такой категории пациентов редко возникают внепеченочные проявления гепатита С (кардиоваскулярные расстройства, аутоиммунные нарушения), что также повышает шансы не только успешной противовирусной терапии, но и быстрого общего восстановления.

При постановке диагноза назначают несколько исследований, таким образом ошибка в проведении тестирования исключается.

Основными маркерами при гепатите С служат:

  1. Положительный результат иммуноферментного анализа. Но ИФА во многом зависит от состояния иммунной системы человека, поэтому на этапе первичной диагностики не исключают ложноположительный либо ложноотрицательный результат.
  2. Коэффициент позитивности при гепатите С выше 1. Рассчитывается по титру антител. Иногда референсные значения могут отличаться в зависимости от используемой тест-системы, но физиологическая норма всегда указывается в бланке с результатами.
  3. Положительный результат качественного теста ПЦР. Обнаружение РНК возбудителя патологии однозначно указывает на инфицирование.
  4. Определяемая виремия  методом количественной ПЦР.

Косвенными лабораторными признаками гепатита С служат:

  • повышение уровня печеночных ферментов, билирубина;
  • изменение уровня лимфоцитов, в некоторых случаях, лейкоцитов, ускорение СОЭ.

Но при ответе на вопрос, какие показатели крови указывают на гепатит С, доктора руководствуются результатами ПЦР, так как ИФА может быть непоказательным при наличии определенных заболеваний (ВИЧ, аутоиммунных расстройств). Также неверные результаты вероятны при беременности, приеме некоторых лекарств. Не последнюю роль играет и анамнез.

Количественный анализ крови

При гепатите С антитела, как и РНК обнаруживаются при помощи тест-систем не сразу, а спустя как минимум 10–14 дней. ИФА может дать достоверный результат позже – через 4–6 недель после инфицирования. Поэтому если есть серьезные основания предполагать контакт с кровью больного, при негативном результате все анализы имеет смысл повторить через 1–1,5 месяца.

В современных лабораториях тестирование проводят с соблюдением всех норм (в соответствии с требованиями отечественного и зарубежного законодательства), но исключить вероятность ошибок и ложных результатов нельзя.

Если на выполнение ИФА оказывает влияние состояние иммунной системы человека, правильность выполнения ПЦР зависит от:

  • соблюдения стерильности при заборе, транспортировке и работе с образцами крови пациента, чтобы исключить возможный контакт с контаминированными образцами;
  • соблюдения температурного режима и других правил при хранении и перевозке пробирок с кровью;
  • правильности постановки ПЦР (начиная от работы лаборанта и заканчивая функционированием автоматических диагностических систем);
  • качества используемых лабораторных материалов.

Но количественный анализ проводится на основании уже выполненных исследований, которые однозначно указывают на наличие HCV (ИФА и качественная ПЦР). Поэтому при отрицательном результате на фоне подтвержденного диагноза исследование повторяют. Кроме того, обращают внимание, как обозначается гепатит С в анализах.

В некоторых клиниках могут пользоваться устаревшей системой, когда виремия указывается не в международных единицах, а в количестве копий. Иногда путаница возникает с подсчетом нулей в указанных цифрах. Именно поэтому расшифровкой обозначений в бланке результатов должен заниматься врач. 

Спорные моменты интерпретации результатов

Расшифровка результатов количественного ПЦР-теста должна проводиться лечащим врачом пациента. Необходимо дать оценку диагностического показателя и определить терапевтическую тактику.

Стандартный анализатор способен выдавать количественный показатель, который отражает число копий вирусной ДНК, присутствующих в исследуемой венозной крови. Единицы измерения — копии/мл, МЕ/мл (копии на миллилитр, международные единицы на миллилитр). Расшифровка результатов приведена в таблице с указанием разных единиц измерения.

Копии/мл МЕ/мл Характеристика Тактика лечения
{amp}lt;750{amp}gt; {amp}lt;360{amp}gt; Концентрация вируса ниже диапазонного показателя, норма Определение тактики по клиническим данным, результатам биохимического, иммуноферментного, инструментального обследования.
{amp}lt;10{amp}gt;5 {amp}lt;2*10{amp}gt;4 Умеренная виремия Тактика определяется результатами биопсии печени, биохимического анализа.
{amp}gt;105 {amp}gt;2*104 Высокая виремия Показана противовирусная терапия, умеренный риск хронизации.
{amp}gt;1*108 {amp}gt;4,8*107 Показатель выше диапазона значений анализатора Проведение комбинированной противовирусной терапии с мониторингом виремии. Высокий риск хронизации HBV.

Анализатор способен выдавать один качественный показатель «не обнаружено». Он означает, что ДНК вируса в исследуемом материалы не были определены, либо их число находится ниже чувствительности аппарата (диагностическая норма).

Кровь для анализа

Анализатор распределяет значения в линейном диапазоне концентраций. У современных аппаратах он определен детектирующим амплификатором и находится в пределе от 750 до 1*108 копий на миллилитр. В международных единицах на миллилитр — от 360 до 4.8*107.

Расшифровка показателей, которые определяет количественный ПЦР-анализатор, позволяет сделать единственно возможное заключение о состоянии пациента. Однако существует значение, вызывающее неоднозначные трактовки. Результат «не обнаружено» может свидетельствовать как о полном отсутствии вирусных частиц гепатипа В, так и о их низком числе, то есть ниже линейного диапазона, улавливаемого детектирующим амплификатором.

Поскольку анализ проводится после положительного иммуноферментного теста, то вероятность контакта с вирусом велика. Это либо условная норма (поствакцинальная реакция), либо малая виремия после заражения. Тактика наблюдения, как и при умеренной виремии, должна включать анализ аминотрансфераз и ультрасонографию печени с повторным проведением ИФА.

В прочих клинических ситуациях расшифровать количественный тест ПЦР — значит решить диагностические сложности, возникшие из-за недостатков ИФА-исследований. Это — окончательный метод, позволяющий решить, присутствует ли вирус в крови пациента, способен ли он вызвать развитие хронического гепатита, или это норма клинического течения.

При этом возможность выявления ДНК HBV в инкубационном периоде до момента синтеза антител гарантирует раннее выявление. Это важное диагностическое преимущество, которое в значительной степени влияет на прогноз при неосторожном очевидном заражении. Подобное может наблюдаться при заражении оперирующего хирурга или пациента при переливании крови.

Преимущества количественного теста

Определение вирусной нагрузки возможно и с использованием других методик, включая серологические. Так, исследование на антиген core считают альтернативой количественной ПЦР.

Но большинство врачей отдают предпочтение ПЦР благодаря:

  • доступности и качеству тест-систем: их производством занимаются ведущие мировые фармацевтические и медикотехнологические корпорации;
  • быстроте и простоте выполнения;
  • высокой чувствительности: современные методики ПЦР позволяют обнаружить РНК патогена в количестве 5 МЕ/мл;
  • универсальности: количественное определение проводится одинаковыми методиками вне зависимости от генотипа HCV;
  • объективности вне зависимости от состояния здоровья пациента (в отличие от ИФА), что позволяет проводить исследования на разных этапах диагностики и лечения;
  • отсутствию влияния на результаты принимаемых лекарств. 

Сейчас ПЦР остается основным методом количественного определения виремии. Тест используется повсеместно практически во всех лабораториях и больницах. Но во избежание ошибок, перед сдачей анализа нужно поинтересоваться, по какой технологии будет проводиться исследование, чтобы соотнести результаты дальнейших анализов.